LITOS : un outil d'éclairage LED polyvalent pour la stimulation optogénétique

Dec 22, 2023

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 13139 (2022) Citer cet article

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L'optogénétique est devenue un outil clé pour manipuler les processus biologiques avec une résolution spatio-temporelle élevée. Récemment, un certain nombre de dispositifs d'éclairage multi-puits commerciaux et open-source ont été développés pour fournir un débit dans les expériences d'optogénétique. Cependant, les dispositifs commerciaux disponibles restent chers et manquent de flexibilité, tandis que les solutions open source nécessitent des connaissances en programmation et/ou incluent des processus d'assemblage complexes. Nous présentons un outil d'éclairage LED pour la stimulation optogénétique (LITOS) basé sur une carte de circuit imprimé assemblée contrôlant une matrice LED 32 × 64 disponible dans le commerce comme source d'éclairage. LITOS peut être rapidement assemblé sans aucune soudure et comprend une interface facile à utiliser, accessible via un site Web hébergé sur l'appareil lui-même. Des schémas de stimulation lumineuse complexes peuvent facilement être programmés sans expertise en codage. LITOS peut être utilisé avec différents formats de plaques multipuits, de boîtes de Pétri et de flacons. Nous avons validé LITOS en mesurant l'activité de la voie de signalisation MAPK/ERK en réponse à différents régimes de stimulation lumineuse dynamique à l'aide d'actionneurs optogénétiques FGFR1 et Raf. LITOS peut stimuler uniformément toutes les cellules d'un puits et permet des schémas de stimulation temporelle flexibles. L'abordabilité et la facilité d'utilisation de LITOS visent à démocratiser l'optogénétique dans n'importe quel laboratoire.

Alors que l'optogénétique a d'abord été utilisée en neurobiologie1, elle est maintenant largement utilisée pour contrôler une grande variété de processus biologiques cellulaires avec une résolution spatio-temporelle élevée2. Cela a été rendu possible par la découverte d'un certain nombre de domaines protéiques sensibles à la lumière qui ont été conçus pour construire des actionneurs permettant de contrôler presque tous les processus biologiques cellulaires2. La précision de l'optogénétique pour perturber les systèmes cellulaires peut conduire à une meilleure compréhension de leur régulation dynamique3. Cependant, les expériences optogénétiques nécessitent également un matériel de stimulation optique approprié.

Une configuration expérimentale optogénétique classique utilise des microscopes optiques automatisés pour stimuler les cellules exprimant des actionneurs optogénétiques et pour enregistrer toute sortie cellulaire souhaitée. Lorsqu'elle est combinée avec des biocapteurs spectralement compatibles dans un microscope à fluorescence, cette configuration peut à la fois contrôler l'entrée cellulaire à l'aide de l'actionneur optogénétique et enregistrer la dynamique de sortie à l'aide du biocapteur4. Cela s'est avéré être une approche très puissante pour étudier la dynamique de signalisation5,6,7. Malheureusement, le champ de vision du système de lentilles du microscope limite le nombre de cellules qui reçoivent la stimulation lumineuse. Ainsi, les microscopes ne peuvent pas stimuler suffisamment de cellules pour mesurer les sorties cellulaires à l'aide de méthodes biochimiques. En outre, le nombre de modèles de stimulation d'entrée différents pouvant être induits en parallèle est limité. Enfin, tout contrôle optogénétique à long terme des cellules à des échelles de temps de plusieurs jours pourrait être peu pratique ou trop coûteux, en particulier dans les installations de microscopie.

L'utilisation d'une source d'éclairage dédiée pour séparer la stimulation du processus d'imagerie contourne certaines de ces limitations. Les bandes de LED montées dans un incubateur peuvent être utilisées pour stimuler un actionneur optogénétique dans un grand nombre de cellules, ouvrant la possibilité de mesurer les sorties cellulaires à l'aide de méthodes biochimiques telles que le western blot, la protéomique ou la transcriptomique8.

Des configurations plus avancées combinent des microcontrôleurs et des sources lumineuses pour éclairer spécifiquement des puits individuels à partir de plaques multipuits. Cela permet de stimuler plusieurs puits avec différents modèles d'entrées de lumière en parallèle, ce qui entraîne un débit expérimental plus élevé. Un certain nombre de solutions matérielles qui tirent parti des LED comme sources d'éclairage ont été développées9,10,11,12. Ces appareils open source sont assez bon marché mais nécessitent des connaissances en programmation et peuvent s'appuyer sur une expertise de fabrication non disponible dans la plupart des laboratoires. Récemment, certains produits commerciaux (ex. LUMOS d'AXION Biosystems) ont fait leur entrée sur le marché, mais leur coût demeure élevé. Un appareil bon marché, facile à assembler et convivial qui offre une flexibilité expérimentale fait toujours défaut dans la communauté optogénétique.

Nous présentons ici un nouvel outil d'éclairage LED pour la stimulation optogénétique (LITOS) pour démocratiser l'optogénétique dans n'importe quel laboratoire de biologie cellulaire. LITOS permet une stimulation lumineuse dynamique à haut débit de grandes populations cellulaires dans différents formats de plaques multipuits, boîtes de Pétri ou flacons de culture cellulaire. Sa convivialité permet aux utilisateurs ayant peu de connaissances techniques et aucune compétence en codage d'utiliser facilement l'appareil et de configurer des modèles d'éclairage complexes. De plus, LITOS peut être facilement assemblé avec un minimum d'outils. Nous fournissons une description détaillée de l'assemblage LITOS et nous documentons une solution d'interface graphique conviviale pour configurer des modèles d'éclairage complexes. Nous avons validé LITOS en utilisant des lignées cellulaires de mammifères exprimant des actionneurs optogénétiques basés sur FGFR1 et Raf, et en évaluant la voie des protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK)/kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) comme sortie de signalisation, en utilisant à la fois des approches biochimiques et d'imagerie.

Pour minimiser le besoin de procédures de fabrication complexes, nous avons entièrement basé LITOS sur des composants disponibles dans le commerce (Figs. 1, 2a). LITOS s'appuie sur une carte de circuit imprimé (PCB) personnalisée, qui peut être commandée pré-assemblée auprès d'un fabricant de PCB. Le PCB agit comme une unité de contrôle pour une matrice LED RVB disponible dans le commerce. Le PCB contient un microcontrôleur ESP32, qui fournit une puissance de calcul suffisante pour contrôler la matrice LED et un nœud de réseau sans fil (Fig. 2b). La matrice LED RVB se compose d'un réseau de 32 × 64 LED avec un pas de 3 mm qui permet un éclairage avec n'importe quelle combinaison de lumière rouge, verte et bleue. Il peut illuminer des cellules cultivées dans des plaques multi-puits de 6, 12, 24, 48 ou 96, ainsi que des boîtes de Pétri et des flacons de culture cellulaire (Fig. 2c). Nous avons choisi ce format de matrice LED à pas de 3 mm car il s'aligne parfaitement sur la disposition typique de la plaque à 96 puits (9 mm), ce qui donne une matrice de LED 2 × 2 centrée dans chaque puits. De plus, la matrice LED RGB permet à l'utilisateur de moduler à volonté l'intensité des trois couleurs. Chacune des LED individuelles produit un cône de lumière qui éclaire une zone qui augmente avec la distance entre l'échantillon et la LED. Par conséquent, en augmentant la distance entre l'échantillon et la LED, le champ d'éclairage devient progressivement plus homogène (Fig. S1a, b supplémentaire). Nous montrons que lorsque l'échantillon est placé à 2 mm des LED, ce qui est le cas dans les 96 plaques multi-puits que nous avons utilisées dans cette étude, il est soumis à un éclairement homogène, avec une variation d'intensité lumineuse maximale de 25 % en bord de puits. L'augmentation de cette distance améliore encore l'homogénéité de l'éclairage, mais au prix d'un éclairage partiel des puits voisins dans une plaque multipuits à 96 (Fig. S1a, b supplémentaires). Bien que cela reste une option, LITOS ne nécessite donc pas de diffuseur de lumière pour améliorer l'uniformité d'éclairage dans un puits, comme utilisé dans des dispositifs similaires9. De plus, la matrice LED du LITOS permet de contrôler des LED individuelles dans un puits d'une plaque multipuits à 96 puits pour créer des motifs d'éclairage lumineux non homogènes qui pourraient être avantageux dans certaines expériences (Fig. S1c supplémentaire). En modulant l'intensité des LED individuelles, LITOS peut générer des gradients de lumière sur des échelles de cm (Fig. S1d supplémentaire).

Schémas des composants LITOS. LITOS est composé de deux parties : une carte de circuit imprimé (PCB) qui agit comme une unité de contrôle et une matrice de LED RVB 32 × 64 disponible dans le commerce. LITOS peut être contrôlé avec un ordinateur ou un smartphone via une connexion WLAN. Le PCB contrôle la matrice LED RVB 32 × 64 pour éclairer les cellules optogénétiques. La matrice LED à pas dense permet l'éclairage de diverses boîtes de culture cellulaire et plaques à puits. Avec un écran et quatre boutons, LITOS peut être contrôlé directement et peut afficher des messages concernant l'exécution d'une expérience ou des actions nécessitant une intervention de l'utilisateur.

LITOS peut générer des schémas de stimulation lumineuse flexibles. (a) Lors de l'assemblage, LITOS est composé du PCB et de la matrice 32 × 64 LED. Ici, LITOS est utilisé pour générer une matrice 8 × 12 de 4 LED par puits pour stimuler chaque puits d'une plaque de 96 puits. (b) Le PCB fournit tout le nécessaire pour faire fonctionner la matrice : le microcontrôleur avec module WLAN, les connexions à la matrice LED, un écran et quatre boutons pour les actions définies par l'utilisateur (par exemple, marquer un contour de plaque, début d'expérience et fin d'expérience). (c) Exemples d'applications LITOS avec différents formats d'assiettes ou de plats. Panneau de gauche : stimulation simultanée de deux plaques de 96 puits, à l'aide d'un masque en plexiglas en option pour l'alignement des plaques. En haut à droite : deux boîtes de Pétri de 100 mm. En bas à gauche : modèle d'éclairage alterné pour une seule plaque de 96 puits. En bas à droite : modèle de stimulation pour une plaque à 6 puits.

Le module PCB et la matrice LED RVB sont connectés avec un câble plat et un câble d'alimentation. Cette procédure d'assemblage simple ne nécessite aucune soudure. Les schémas de LITOS ainsi que pour un boîtier imprimé en 3D en option (Fig. S2 supplémentaire) sont sur notre page GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS).

Pour faciliter l'alignement des plaques dans des environnements sombres, nous avons mis en œuvre 3 solutions : (i) utiliser LITOS pour afficher un contour de référence de la plaque de puits souhaitée sur la matrice LED, qui peut être directement activé par un bouton sur le PCB (Fig. S3a supplémentaire) ; (ii) aligner la plaque sur le coin supérieur gauche de la matrice LED (Fig. S3b supplémentaire) et (iii) utiliser un masque qui positionne la plaque sur la matrice LED (cette dernière peut être réalisée par impression 3D ou fraisage CNC) (Fig. S3c supplémentaire). L'utilisation d'un tel masque permet également de placer et de stimuler simultanément deux plaques multipuits sur un appareil LITOS.

Le coût global de LITOS, qui comprend un PCB personnalisé assemblé par un fabricant de PCB, et une matrice LED standard, représente environ 200,00 USD. Ce bas prix de l'appareil permet d'augmenter facilement les expériences en commandant plus d'unités. Lors de la commande de plusieurs appareils, le prix unitaire peut encore être réduit.

Comme pour le matériel, le logiciel de LITOS a été conçu pour être convivial. Le logiciel présent sur l'unité de contrôle utilise des schémas d'éclairage définis par l'utilisateur, qui sont ensuite traités pour contrôler la matrice LED (Fig. 3a–c).

Flux de travail utilisateur général LITOS. (a) Schéma du flux de travail expérimental pour générer des modèles d'éclairage spécifiques. Un fichier csv avec le modèle souhaité peut être téléchargé via un navigateur Web vers "l'interface de configuration" hébergée par l'unité de contrôle. L'unité de commande fait ensuite fonctionner la matrice LED en fonction du motif d'éclairage téléchargé. (b) Exemple de fichier csv utilisé pour un motif d'éclairage spécifique. Ici, les puits A01 et B01 sont programmés pour être éclairés toutes les 5 min avec une impulsion de lumière bleue de 3 s ; Les puits C01 et D01 sont programmés avec le même schéma mais avec un retard de 30 min. Dans les deux cas, l'expérience a une durée totale de 1 h. (c) L'interface utilisateur hébergée par LITOS est utilisée pour transférer les modèles d'éclairage, qui peuvent ensuite être chargés pour des expériences d'optogénétique.

Aucune connaissance en programmation n'est nécessaire pour configurer les modèles d'éclairage souhaités. Pour définir quelles LED doivent être allumées, à quelle heure spécifique, pour quelle durée spécifique et dans quelle couleur spécifique, l'utilisateur crée un fichier de valeurs séparées par des virgules (csv). Cela peut être fait à l'aide d'applications de tableur, telles que Google Sheets, Microsoft Excel ou LibreOffice Calc. Dans le fichier csv, chaque ligne décrit une commande d'illumination (Fig. 3b). Chaque colonne indique différents paramètres du programme de stimulation : LEDs à activer, heure de début d'éclairage, durée d'éclairage, couleur et intensité des LEDs actives. Pour libérer une partie des ressources limitées du microcontrôleur pour d'autres processus logiciels, nous avons limité la durée d'impulsion minimale à 1 s. D'autres colonnes permettent la génération de boucles pour répéter un motif de stimulation plusieurs fois (par exemple, illuminé toutes les 10 min pendant 3 h). Afin que l'utilisateur n'ait pas toujours à définir des LED individuelles, nous avons conçu des mots-clés pour éclairer des régions prédéfinies : (i) Puits (par exemple, "A02"/"A2" pour Puits A02) ; (ii) Colonne et ligne (par exemple, "D" pour toute la ligne D); (iii) plaque multipuits entière (Plate); (iv) matrice entière (Whole); (v) cercle et rectangles (Rec_start_end). Le logiciel de LITOS traduit ces mots-clés dans les positions LED correspondantes de la matrice. Pour plus de flexibilité, il est également possible de contrôler des LED individuelles, permettant par exemple la génération de dégradés d'intensité et/ou de couleur, ou l'affichage de texte.

De plus, dans ces fichiers csv, des messages personnalisés avec des comptes à rebours peuvent être programmés pour être affichés sur l'unité de contrôle. Cela peut aider l'utilisateur pour toutes les tâches supplémentaires au cours de l'expérience optogénétique, telles que le pipetage d'un réactif dans un puits spécifique, par exemple. Comme ces tâches peuvent être sensibles au temps, un petit buzzer piézo assiste l'utilisateur avec des signaux auditifs supplémentaires en plus des signaux visuels.

Le fichier csv du motif d'éclairage est ensuite transféré à l'unité de contrôle via son module Wi-Fi. Une interface de configuration basée sur java-script (Fig. 3c) est hébergée sur l'unité de contrôle pour télécharger et gérer les modèles d'éclairage, modifier les paramètres et préparer LITOS pour une expérience. Plusieurs modèles d'éclairage peuvent être stockés dans la mémoire interne de l'unité de contrôle, ce qui permet de réutiliser les modèles de stimulation sans avoir à les télécharger à nouveau. L'interface de configuration de l'unité de contrôle est accessible via un point d'accès WLAN créé par LITOS ou via le réseau Wi-Fi local. Les informations nécessaires à la connexion, telles que l'adresse IP de LITOS ou le nom du point d'accès WLAN créé, sont affichées sur l'écran interne. Une fois connecté, l'utilisateur peut accéder à l'interface de configuration depuis un navigateur web sur n'importe quel ordinateur ou smartphone indépendamment de la plateforme.

Une fois qu'un motif d'éclairage est transféré et sélectionné, LITOS est prêt à effectuer l'expérience. Les boutons LITOS permettent à l'utilisateur de naviguer dans le menu, de démarrer ou d'abandonner l'expérience, ou d'indiquer avec un contour sur la matrice RVB où placer la plaque multipuits. La progression actuelle d'un programme d'éclairage sur LITOS peut être directement surveillée sur l'écran de l'unité de commande. Le film supplémentaire S1 montre la matrice LED appliquant un motif de stimulation dans lequel chaque colonne d'une plaque à 96 puits est éclairée séquentiellement.

Lors des premières expériences, nous avons constaté que la matrice LED développait de la chaleur qui pourrait éventuellement nuire à la santé des cellules. Nous avons constaté que la matrice LED chauffe même à l'état inactif lorsqu'aucune stimulation lumineuse ne se produit. Pour résoudre ce problème, nous avons intégré un circuit utilisant des transistors à effet de champ métal-oxyde-semi-conducteur (MOSFET) N et P dans l'unité de commande de LITOS pour fournir un courant électrique à la matrice uniquement lorsqu'un processus d'éclairage est requis. Cela a réduit le développement de chaleur observé pour les schémas de stimulation répétitifs. Nous avons ensuite évalué le changement de température du milieu dû à l'éclairage LITOS en mesurant la température du milieu après différents modèles de stimulation. Comme prévu, nos mesures montrent qu'une stimulation lumineuse plus longue et plus fréquente a entraîné une augmentation de la température plus élevée, qui a atteint un plateau après environ 1 h (Fig. S4 supplémentaire). Cependant, les expériences présentées dans cet article n'ont jamais nécessité de schémas de stimulation lumineuse qui produiraient suffisamment de chaleur pour compromettre la santé des cellules. Dans le cas où les expériences nécessitent de très longues entrées de lumière soutenues, l'ajout de petits dissipateurs thermiques passifs pourrait permettre de réduire la surchauffe. Une autre approche consiste à concevoir le module optogénétique avec un faible koff pour provoquer des interactions soutenues dépendant de la lumière. Par exemple, dans le système iLID (dimère inductible par la lumière amélioré), les affinités et les durées de vie de l'interaction dépendante de la lumière peuvent être modifiées par diverses mutations13.

LITOS se prête à un large éventail d'applications optogénétiques et de systèmes modèles. Pour démontrer la flexibilité et la polyvalence de LITOS, nous avons effectué des expériences optogénétiques pour étudier la voie MAPK/ERK. Le réseau MAPK est capable de décoder une variété d'indices extracellulaires et intracellulaires, de les convertir en décisions de destin spécifiques, et joue un rôle central à la fois en physiologie et en pathologie14. Pour cette raison, plusieurs actionneurs optogénétiques et biocapteurs fluorescents ont été développés pour contrôler et mesurer différents nœuds de signalisation de cette voie, ce qui en fait un système modèle idéal pour présenter LITOS.

Nous avons utilisé des fibroblastes de souris NIH3T3 et des lignées de cellules épithéliales mammaires MCF10A, conçues pour exprimer de manière stable un circuit génétiquement codé composé d'un actionneur optogénétique pour activer différents nœuds du réseau MAPK et d'un biocapteur fluorescent pour enregistrer la dynamique de la sortie de signalisation ERK. Ce circuit consiste en un récepteur optogénétique du facteur de croissance des fibroblastes (optoFGFR), qui consiste en un domaine intracellulaire myristoylé du récepteur 1 du facteur de croissance des fibroblastes fusionné avec le domaine sensible à la lumière CRY2 qui, lors de la stimulation avec la lumière bleue, se multimérise, s'autophosphoryle et active la voie MAPK4. La sortie de signalisation ERK peut ensuite être mesurée à l'aide d'un journaliste de translocation de kinase ERK (KTR) qui rend compte de l'activité ERK à une résolution unicellulaire15. Pour être spectralement compatible avec l'activation optogénétique, ERK-KTR est fusionné avec une protéine fluorescente rouge mRuby2 qui peut être excitée sans activer l'optoFGFR. De plus, les deux lignées cellulaires expriment de manière stable un marqueur nucléaire histone H2B fusionné à la protéine fluorescente rouge lointain miRFP703 (H2B-miRFP703). Un schéma de ce circuit génétique est présenté sur la figure 4a. Nous avons ensuite utilisé une approche de vision par ordinateur pour déduire l'état d'activation ERK pour chaque cellule (Fig. 4b). À cette fin, les noyaux ont été automatiquement segmentés à l'aide du canal H2B-miRFP703 et utilisés pour dériver un masque nucléaire et un masque annulaire cytosolique autour du noyau. Ensuite, un rapport des intensités médianes de fluorescence du canal ERK-KTR-mRuby2 utilisant les masques cytosoliques et nucléaires est calculé comme proxy pour l'activité ERK (rapport C/N)16.

LITOS dans l'étude de la dynamique de signalisation de la voie MAPK. (a) Lors de la stimulation de l'optoFGFR, la voie MAPK est activée, conduisant à la phosphorylation et à l'activation ultérieure de ERK. Active ERK phosphoryle ERK-KTR, conduisant à sa translocation réversible dans le cytosol. (b) Pipeline de vision par ordinateur pour l'analyse d'images. La segmentation nucléaire des cellules NIH3T3 (rouge), basée sur le marqueur nucléaire H2B, et son expansion en forme d'anneau (bleu) sont utilisées pour mesurer le rapport entre le cytosol et le noyau (C/N) de ERK-KTR. Un rapport C/N élevé correspond à une activité ERK élevée. ( c ) La rangée supérieure représente le rapport C / N ERK-KTR à code couleur de toutes les cellules NIH3T3 dans des puits de 6, 38 mm de diamètre (plaque à 96 puits). Les deux rangées inférieures représentent un exemple pleine résolution d'un FOV qui compose l'image plus grande ci-dessus, avec H2B-miRFP703 et ERK-KTR-mRuby2 affichés en niveaux de gris inversés. ( d ) Les cellules MCF10A exprimant ERK-KTR ont été stimulées avec une impulsion lumineuse longue de 10 s, fixées avec du paraformaldéhyde à 4% et leur activité ERK a été quantifiée comme indiqué en ( b ). L'activité de l'ERK a ensuite été comparée à un Western blot contre l'ERK phosphorylée et totale des mêmes cellules (ci-dessous). Des Western blots indigènes non cultivés sont disponibles dans la Fig. S4 supplémentaire.

La première caractéristique de LITOS que nous avons évaluée était la capacité du réseau de LED à stimuler de manière homogène toutes les cellules d'un même puits. Cette caractéristique est cruciale pour les applications à l'ensemble de la population. À cette fin, nous avons stimulé des plaques à 96 puits, dans lesquelles chaque puits est éclairé par quatre LED, et mesuré ERK-KTR C/N dans toutes les cellules d'un puits en acquérant une grande image en mosaïque de chaque puits entier. L'affichage des valeurs du rapport ERK-KTR C / N de chaque cellule dans des puits entiers a révélé que les quatre LED d'un même puits induisaient une activation optogénétique robuste et homogène de la voie MAPK (Fig. 4c). Parce que les différentes expériences ont été réalisées dans des puits adjacents, cela montre également que la petite quantité de lumière qui déborde ne conduit pas à l'activation de l'activité ERK.

Nous avons ensuite testé la capacité de LITOS à générer une activation ERK robuste avec une méthode biochimique moyenne de population, en utilisant une analyse Western blot avec un anticorps phosphoERK (pERK). Pour produire suffisamment de lysat de protéines, nous avons ensemencé des cellules MCF10A dans des plaques à 6 puits, produisant environ 250 µg de lysat de protéines par puits. L'éclairage d'un puits entier d'une plaque à 6 puits nécessitait l'allumage de 112 LED (Fig. 2c, panneau inférieur droit). Nous avons stimulé les cellules exprimant l'optoFGFR à l'aide d'une impulsion de lumière bleue de 10 s avec LITOS et fixé les cellules à l'aide de paraformaldéhyde à différents moments avec un intervalle de 3 minutes. Pour comparer la dynamique d'activation ERK observée à l'aide de Western blot par rapport au biocapteur ERK-KTR, nous avons mesuré le rapport ERK-KTR C/N dans tous les puits avant l'extraction des protéines. Pour faire la moyenne de toute variabilité locale des rapports C/N ERK-KTR unicellulaires, nous avons échantillonné chaque puits avec 16 FOV et calculé leur moyenne de population. La mesure par Western blot de pERK endogène suit de près la mesure de l'activité de la kinase ERK à l'aide du biocapteur ERK-KTR. Conformément aux observations précédentes5,16, les signaux pERK et ERK-KTR ont affiché une forte augmentation de l'activité ERK directement après la stimulation lumineuse, suivie d'une adaptation plus lente, qui a conduit à des niveaux d'activité ERK pré-stimulation en 20 min. Le signal ERK-KTR (pic à 6 min) était légèrement retardé par rapport au signal pERK (pic à 3 min) (Fig. 4d). Cela peut refléter le temps dont ERK a besoin pour se déplacer vers le noyau et/ou le temps dont le biocapteur ERK-KTR a besoin pour se déplacer vers le cytosol.

Ces expériences montrent que LITOS peut activer de manière uniforme et fiable toutes les cellules dans un grand puits et démontrent qu'il peut stimuler le grand nombre de cellules nécessaires au western blot. Cela rend LITOS également compatible avec d'autres mesures de moyenne de population (par exemple, transcriptomique ou (phospho)protéomique).

Pour exploiter pleinement le potentiel de l'optogénétique dans le contrôle des processus biologiques dynamiques, LITOS doit être capable d'activer différents actionneurs optogénétiques, ainsi que d'avoir une grande flexibilité dans la création de modèles d'éclairage complexes. Nous avons donc réalisé une série d'expériences supplémentaires pour démontrer que LITOS répond à ces exigences. Dans toutes les expériences suivantes, nous avons programmé LITOS pour appliquer automatiquement les entrées de lumière à différents puits à des moments précis, de sorte que les cellules d'une plaque à 96 puits puissent être fixées simultanément à la fin de l'expérience. Après la fixation des cellules, nous avons imagé tous les puits des plaques à l'aide d'une microscopie automatisée. Nous avons ensuite profité de notre pipeline d'analyse d'images automatisé pour calculer une activité ERK moyenne par puits. Notez que la réalisation de telles expériences avec pipetage de facteurs de croissance pour activer le réseau MAPK d'une manière résolue dans le temps serait très laborieuse.

Nous avons d'abord évalué si LITOS est également capable de stimuler un actionneur optogénétique qui utilise un mécanisme d'activation différent de celui de l'optoFGFR. Contrairement à l'optoFGFR, qui est basé sur la multimérisation d'un récepteur membranaire sensible à la lumière, l'optoRaf17 implique le recrutement dépendant de la lumière d'un domaine catalytique c-Raf sur la membrane via un système CRY2. Pour évaluer si LITOS est également capable de stimuler optoRaf, nous avons examiné des apports lumineux de différentes durées et les avons comparés à la stimulation optoFGFR. Nous avons observé qu'une impulsion lumineuse de 30 s induisait une amplitude ERK plus élevée dans l'optoRaf par rapport au système optoFGFR (Fig. 5a). Cela était également apparent à des moments ultérieurs. En réponse à l'augmentation de l'apport de lumière, l'optoFGFR a conduit à une transition d'une dynamique ERK transitoire à soutenue, comme observé précédemment5, tandis que l'optoRaf a toujours affiché une dynamique ERK adaptative. Les différentes dynamiques ERK induites par les entrées optoFGFR et optoRaf pourraient soit refléter des mécanismes d'actionnement différents, soit une différence dans la capacité des deux actionneurs à activer ERK à différents niveaux au sein du réseau MAPK : optoFGFR déclenche l'activation d'un réseau MAPK complet en aval du récepteur, alors que optoRaf ne déclenche que l'activation d'un réseau MEK/ERK isolé. Cela illustre comment LITOS peut être utilisé pour étudier la dynamique ERK induite par différents actionneurs optogénétiques.

Démonstration de la polyvalence de LITOS dans l'étude de la dynamique de signalisation MAPK. (a) Réponse ERK aux entrées de lumière optoFGFR ou optoRaf à différents moments. ( b ) Petit criblage de médicaments sur NIH3T3 exprimant optoFGFR effectué dans une seule plaque à 96 puits en utilisant différentes concentrations de l'inhibiteur Raf RAF709, de l'inhibiteur ERK SCH772984 et de l'inhibiteur MEK U0126. ( c ) Dynamique de l'activité ERK mesurée après une seule impulsion de lumière bleue longue de 2 s avec LITOS mesurée avec une résolution temporelle de 1 min. ( d ) Comparaison de la dynamique de l'activité ERK pulsatile et soutenue générée avec LITOS. ( a – d ) L'activité ERK a été mesurée en tant que ERK-KTR C / N. Les diagrammes en boîte représentent la médiane (ligne centrale), les 2e et 3e quartiles (boîtes) et 1,5 plage interquartile (moustaches) des mesures ERK-KTR C/N à cellule unique. Les tracés linéaires représentent la moyenne (ligne) et l'erreur standard de l'intervalle moyen (barres d'erreur) des mesures ERK-KTR C/N à cellule unique.

Nous avons ensuite évalué plus en détail le potentiel de LITOS pour effectuer un criblage de médicaments avec la dynamique ERK comme lecture (Fig. 5b). Comme preuve de concept, nous avons testé 3 médicaments qui inhibent la voie MAPK : l'inhibiteur Raf RAF709, l'inhibiteur MEK U0126 et l'inhibiteur ERK SCH772984. Nous avons appliqué chaque inhibiteur à 2 concentrations. Nous avons stimulé les cellules optoFGFR avec une seule impulsion de lumière bleue de 10 s en présence des inhibiteurs et mesuré l'activité ERK à 12 moments différents avec une résolution temporelle de 2 minutes. Les trois médicaments ont entraîné une réduction dose-dépendante de l'activité ERK. Le pic d'activité ERK a été nettement réduit avec les deux concentrations les plus élevées de RAF709 et U0126, voire abrogé avec la concentration la plus élevée de SCH772984 (Fig. 5b). Cela montre que LITOS est adapté pour dépister les perturbations de la dynamique de signalisation avec relativement peu d'effort.

Ensuite, nous avons évalué le potentiel de LITOS pour étudier la dynamique ERK nécessitant une résolution temporelle élevée. À cette fin, nous avons stimulé les cellules optoFGFR avec une seule impulsion de lumière bleue de 2 s et fixé les cellules avec une résolution temporelle de 1 min. Cela a capturé des détails hautement résolus de la dynamique de l'activité ERK, tels que la phase abrupte d'activation ERK suivie d'une phase d'adaptation plus lente (Fig. 5c). Ce résultat souligne la capacité de LITOS à étudier les événements de signalisation rapide.

Les expériences que nous avons documentées jusqu'à présent sont basées sur des impulsions uniques de lumière bleue. Cependant, différents réseaux de signalisation sont connus pour coder différents modèles de signalisation dynamique qui peuvent consister en une dynamique de signalisation transitoire, soutenue, oscillatoire ou pulsatile18. La reproduction de ces profils dynamiques complexes à l'aide d'une approche de biologie synthétique pourrait fournir des informations clés sur le réseau qui façonne ces dynamiques. Par conséquent, nous avons évalué la capacité de LITOS à produire des modèles d'entrée de lumière plus complexes pour évoquer des modèles dynamiques ERK synthétiques spécifiques. Pour ce faire, nous avons programmé LITOS pour stimuler les cellules optoFGFR avec des impulsions lumineuses de fréquence élevée (toutes les 2 min) ou basse (toutes les 20 min) pendant 10 s pendant un total de 84 min. Nous avons constaté que les impulsions lumineuses à haute fréquence évoquent une dynamique ERK soutenue (Fig. 5d). Ceci est cohérent avec la découverte qu'une seule impulsion de lumière bleue allume l'optoFGFR pendant environ 5 à 10 min5, ne permettant ainsi pas à ERK de se désactiver si l'optoFGFR est réactivé toutes les 2 min. En revanche, les impulsions lumineuses à basse fréquence évoquaient des impulsions ERK successives et discrètes qui affichaient toutes une adaptation à la ligne de base jusqu'à ce qu'une nouvelle entrée lumineuse soit appliquée. Cela montre comment LITOS peut être utilisé pour ajuster avec précision la dynamique ERK synthétique définie par l'utilisateur. Cette expérience a nécessité l'application de différents schémas de stimulation lumineuse à 86 puits de la plaque à puits (schémas de stimulation dans les figures supplémentaires S6 et S7), illustrant la complexité des expériences que LITOS peut aborder. LITOS a fourni la résolution temporelle pour capturer une diminution transitoire de la phosphorylation de ERK-KTR (Fig. 5b, d) dont nous avons précédemment montré qu'elle résultait de l'activation de l'optoFGFR-calcineurine5. Dans l'ensemble, ces résultats montrent que LITOS est un dispositif optogénétique très flexible qui permet de réaliser des expériences complexes pour étudier la dynamique de la voie MAPK.

Nous présentons LITOS, un outil de matrice LED convivial, peu coûteux, facile à assembler et robuste dans le but de démocratiser les expériences de stimulation optogénétique en incubateur. LITOS est composé de pièces qui peuvent être facilement achetées en ligne ou commandées auprès du fabricant. Ici et dans un référentiel GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS), nous fournissons des instructions pour assembler et utiliser LITOS. Nous documentons également une solution logicielle dédiée pour contrôler LITOS. Nous comparons LITOS en étudiant la voie de signalisation dynamique MAPK, qui peut être manipulée par différents actionneurs optogénétiques et mesurée à l'aide d'un biocapteur fluorescent. Cela a démontré que la densité de LED dans LITOS est suffisante pour stimuler uniformément toutes les cellules cultivées dans des plaques à puits (Fig. 4c), permettant d'effectuer des mesures fiables de la moyenne de la population à l'aide de méthodes biochimiques telles que le western blot (Fig. 4d). De plus, nous avons montré que LITOS est compatible avec deux actionneurs optogénétiques différents (Fig. 5a), fournit le débit nécessaire pour effectuer de petits criblages de médicaments (Fig. 5b), permet des mesures à haute résolution temporelle (Fig. 5c) et permet l'application de schémas de stimulation lumineuse complexes (Fig. 5d). Ces caractéristiques répondent aux besoins du domaine en pleine expansion de l'optogénétique et de son application à l'étude des processus dynamiques.

L'importance de la régulation dynamique des processus biologiques, y compris la dynamique de signalisation, a été de plus en plus reconnue au cours des dernières années18. La dynamique pulsatile de l'activité ERK observée dans les collectifs épithéliaux est l'un des exemples les plus frappants16,17,19,20,21,22. Ici, il a été démontré que la fréquence des impulsions ERK d'amplitude et de durée constantes contrôle différentes décisions de destin, telles que la mort cellulaire, la survie, la prolifération et la migration16,19,21,22. Les biocapteurs fluorescents nous ont permis de visualiser ces événements de signalisation à des échelles spatiales et temporelles adéquates. L'optogénétique nous permet désormais également de contrôler ces processus biologiques à ces échelles de temps et d'espace biologiquement pertinentes de manière non invasive. Nous avions précédemment montré que l'application d'entrées optoFGFR ou optoRaf modulées en fréquence peut évoquer des régimes dynamiques ERK modulés en fréquence dans lesquels toutes les cellules de la population répondent de manière synchrone16. Cela contraste avec l'application en masse soutenue couramment utilisée de facteurs de croissance qui conduit souvent à des comportements de signalisation hétérogènes et non synchronisés16,19,23. Ici, LITOS révèle à nouveau que cela se produit lorsque des entrées optoFGFR à médiation lumineuse spécifiques sont appliquées. L'application d'une entrée optoFGFR à médiation lumineuse avec LITOS a conduit à une activation ERK abrupte homogène dans la population, suivie d'une adaptation, conduisant toutes les cellules d'une population à subir une impulsion ERK identique (Fig. 4c). Des impulsions lumineuses multiples, appliquées à basse fréquence, pourraient conduire à des impulsions ERK discrètes synchrones avec la population (Fig. 5d). En revanche, lorsque ces impulsions lumineuses étaient appliquées à haute fréquence, ce qui ne permettait pas l'inactivation de l'optoFGFR5, une activité ERK soutenue pouvait être évoquée (Fig. 5d). Nous prévoyons que ces caractéristiques de LITOS, ainsi que d'appareils similaires, augmenteront la fiabilité des mesures biochimiques moyennes de la population telles que le western blot, la transcriptomique ou la (phospho)protéomique. Ici, la capacité d'induire une dynamique ERK synchrone de la population fournira des mesures moyennes fiables de la population à l'aide d'approches biochimiques. Cela contraste avec les expériences de stimulation du facteur de croissance en vrac qui pourraient faire la moyenne d'états de signalisation hétérogènes. Par exemple, nous envisageons que les phosphoprotéomes hautement résolus dans le temps d'une impulsion ERK évoquée par une entrée optoFGFR transitoire pourraient cartographier les fluctuations des phosphosites à des échelles de temps biologiquement pertinentes, offrant une meilleure compréhension de la signalisation du récepteur tyrosine kinase-MAPK. Alternativement, la capacité d'évoquer la dynamique ERK synthétique souhaitée qui peut induire des décisions de destin spécifiques (par exemple, la survie, la prolifération, la différenciation), lorsqu'elle est couplée à des approches omiques (par exemple, transcriptomique, (phospho)protéomique) pourrait fournir de nouvelles informations sur la façon dont la dynamique ERK est décodée en décisions de destin. En tirant parti du répertoire en constante expansion des actionneurs optogénétiques et des biocapteurs, nous envisageons qu'une logique expérimentale similaire puisse être appliquée à d'autres systèmes de signalisation.

Un autre potentiel important de LITOS réside dans l'étude des processus biologiques qui se produisent sur des échelles de temps sur plusieurs jours et qui nécessiteraient des microscopes dédiés pendant de longues périodes pour la stimulation optogénétique. Ceci est illustré par une étude distincte dans laquelle nous avons utilisé LITOS pour contrôler optogénétiquement la signalisation ERK dans la morphogenèse des acini mammaires 3D, un processus de développement qui se déroule sur une période de 2 semaines24. Nous nous sommes concentrés sur un épisode de développement dépendant de ERK dans lequel la lumière acineuse est formée par la survie des cellules externes et l'apoptose de la masse cellulaire interne dans un processus qui prend environ une semaine. Nous avons constaté que la fréquence des impulsions ERK était plus élevée dans les cellules externes que dans les cellules internes, et avons émis l'hypothèse que la fréquence des impulsions ERK dicte donc la survie par rapport au destin de l'apoptose. À l'aide d'actionneurs optoFGFR et optoRaf, nous avons utilisé LITOS pour évoquer différents régimes d'impulsions synthétiques modulées en fréquence ERK. Nous avons observé que les régimes d'impulsions ERK à haute fréquence ont sauvé les phénotypes de survie dans les cellules internes, entravant la formation de la lumière de l'acinus. Ces résultats illustrent comment LITOS peut contrôler les événements morphogénétiques qui se produisent sur plusieurs jours dans des expériences réalisées dans un incubateur de culture tissulaire. Nous envisageons que le contrôle médié par LITOS des actionneurs optogénétiques pourrait être utilisé pour un large éventail d'applications en biologie 3D, y compris la culture organoïde.

La conception simple de LITOS le rend polyvalent et abordable. Bien que nous ayons limité notre étude aux systèmes basés sur CRY2, la matrice LED RVB de LITOS devrait également permettre le contrôle des actionneurs optogénétiques basés sur les domaines cryptochrome, dronpa et LOV (par exemple, iLID, TULIP)25. Cependant, la simplicité de LITOS peut également s'accompagner de certaines limitations. La densité de puissance maximale se situe dans la partie inférieure de la plage par rapport aux autres appareils open source et commerciaux (tableau supplémentaire S1). Nous recommandons aux nouveaux utilisateurs de tester si leur système optogénétique préféré peut être activé par l'intensité lumineuse produite par LITOS. De plus, LITOS n'est pas spectralement compatible avec les actionneurs à base de phytochrome qui nécessitent une lumière infrarouge. Cependant, nous prévoyons que de nouveaux actionneurs optogénétiques pouvant être activés avec des longueurs d'onde supplémentaires seront disponibles à l'avenir26 et élargiront la gamme d'applications de LITOS.

En résumé, nous avons développé et testé LITOS, un dispositif d'éclairage à LED bon marché, robuste et facile à utiliser pour l'optogénétique. Nous avons illustré comment LITOS pourrait être utilisé dans l'étude de la signalisation MAPK. Nous envisageons une large gamme d'applications pour LITOS en dehors du domaine de la signalisation. Par exemple, il pourrait être appliqué pour étudier l'expression génique contrôlée par la lumière chez les bactéries27, la recherche en biologie du développement chez la drosophile28 ou pour l'édition du génome photoactivable CRISPR-Cas929.

De plus amples informations sur LITOS, comment en commander un et son code open source sont disponibles dans le référentiel GitHub suivant (https://github.com/pertzlab/LITOS).

LITOS se compose d'une matrice LED RVB disponible dans le commerce (module d'affichage LED intérieur P3, 32 × 64 pixels, avec circuit intégré FM6126A, de Shenzhen Xuyang Technology Co. Ltd., bien que des modules avec d'autres circuits intégrés puissent également être potentiellement utilisés) pour la stimulation cellulaire et une carte de circuit imprimé (PCB) personnalisée. Les émissions maximales de la LED de la matrice RVB sont de 620 à 630 nm pour le rouge, de 520 à 525 nm pour le vert et de 465 à 470 nm pour le bleu. Pour chaque LED, 256 niveaux d'intensité peuvent être définis avec une densité de puissance maximale pour la LED bleue de 135 ± 0,11 µW/cm2. Le PCB est construit autour du module ESP32-WROOM (Espressif systems Shanghai Co. ltd.) et agit comme une unité de contrôle pour la matrice LED. Outre les circuits nécessaires à cette tâche, un module d'écran OLED de 1,5 pouces (avec circuit intégré de contrôle SSD1351) et un buzzer (AI-1223-TWT-3 V-2-R, audio PUI) offrent des possibilités de sortie audiovisuelle supplémentaires. Les boutons de commande (B3F-4050, Omron) sont utilisés pour la saisie de l'utilisateur. La programmation initiale peut être effectuée par le pont UART série USB ajouté (231-XS, FTDI). L'alimentation est fournie par un adaptateur secteur mural externe de 5 V, connecté à un connecteur jack cylindrique de 2,1 mm × 5,5 mm placé sur le circuit imprimé. Comme certains composants nécessitent une tension inférieure à 3,3 V, un régulateur de tension linéaire (LM1117, Texas Instruments) a été ajouté au PCB. Le schéma de circuit de LITOS, les fichiers de mise en page du PCB (générés avec KiCad 6.01, https://www.kicad.org/) et sa nomenclature se trouvent dans notre référentiel GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS).

Le PCB est connecté à la matrice LED RVB avec un câble qui fournit la puissance requise et avec un câble plat à 16 broches utilisé pour la transmission du signal. Les deux câbles se connectent au PCB et à la matrice LED RVB via les en-têtes existants. Enfin, le PCB est connecté à l'alimentation externe 5 V. De plus, le PCB peut être connecté à un ordinateur via un câble USB. Ceci est nécessaire pour charger initialement le logiciel LITOS sur le microcontrôleur ESP32 (s'il n'est pas chargé par le fabricant de PCB). Après cela, la connexion à un ordinateur est établie via Wi-Fi.

Pour mesurer le champ d'illumination, nous avons exposé du papier photographique (Ilford Multigrade RC DeLuxe 44 M pearl) à une lumière bleue de 1 s produite par LITOS à différentes intensités, comme spécifié dans la légende. Nous avons positionné le papier photographique sur une lame de verre de 0,17 mm à différentes distances de la matrice LED en utilisant des expositions identiques. Après avoir exposé le papier photographique à la lumière bleue, nous l'avons développé pendant 1 min. Les photos des champs d'éclairage ont été numérisées en échelle de gris avec une résolution de 400 dpi. Les profils d'intensité des champs d'éclairage ont été produits avec ImageJ 1.53.

L'ESP32, situé sur le PCB, est programmé en C/C++ en utilisant la couche d'abstraction matérielle Arduino. L'interface de configuration est programmée dans Vue, un framework Web progressif permettant de créer l'interface de configuration sous forme d'applications à page unique (https://vuejs.org/). Le code source se trouve dans notre référentiel GitHub (https://github.com/pertzlab/LITOS).

La lignée cellulaire de fibroblastes embryonnaires de souris NIH3T3 était un don de T. Hunter, Salk Institute for Biological Studies à La Jolla, Californie. La lignée de cellules épithéliales mammaires humaines non tumorigènes MCF10A était un don de JS Brugge, Harvard Medical School, Boston, MA. Nous avons maintenu des cellules NIH3T3 dans le Dulbecco's Modified Eagle's Medium–high glucose (DMEM) de Sigma-Aldrich (Réf : D5671) complété avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 200 U/ml de pénicilline et 200 µg/ml de streptomycine et 200 nM de l-glutamine. Avant le passage, la confluence a été maintenue en dessous de 40 à 50 % pour éviter des changements dans le comportement des cellules NIH3T3. Les cellules MCF10A ont été maintenues dans du DMEM:F12 (D8437) de Sigma-Aldrich additionné de 5% de sérum de cheval, 200 U/ml de pénicilline et 200 µg/ml de streptomycine, 20 ng/ml d'EGF (Peprotech), 10 µg/ml d'insuline (Sigma-Aldrich/Merck) et 0,5 µg/ml d'hydrocortisone (Sigma-Aldrich /Merck).

Les cellules NIH3T3 et MCF10A ont été affamées dans un milieu composé de Ham's F-12 Nutrient Mixture (Sigma N4888) avec 200 U/ml de pénicilline et 200 µg/ml de streptomycine et 200 nM de L-Glutamine et 0,5 % d'albumine de sérum bovin pour les cellules NIH3T3 et DMEM:F12 (Sigma D8437) additionné de 0,3 % BSA, 0,5 µg/ml d'hydrocortisone et 200 U/ml de pénicilline et 200 µg/ml de streptomycine pour les cellules MCF10A. Les cellules NIH3T3 et MCF10A ont été modifiées de manière stable pour exprimer optoFGFR (fusionné avec une protéine fluorescente mCitrine) ou optoRAF (fusionné avec une protéine fluorescente mCitrine également). OptoFGFR a été transduit par un vecteur lentiviral (Lyn-cytoFGFR1-PHR-mCit) et optoRAF par un plasmide PiggyBac (pPB3.0.PURO.CRY2.cRAF.mCitrine.P2A.CIBN.KrasCT). Les deux systèmes expriment une résistance à la puromycine que nous avons utilisée pour sélectionner des cellules transduites de manière stable. Les lignées cellulaires exprimant ces actionneurs optogénétiques ont ensuite été transfectées avec deux plasmides PiggyBac supplémentaires pour exprimer de manière stable ERK-KTR-mRuby2 avec résistance à l'hygromycine et le marqueur nucléaire H2B-miRFP703 avec résistance à la blasticidine. Pour les cellules NIH3T3, les plasmides PiggyBac ont été transfectés en utilisant le réactif de transfection jetPEI. Pour les cellules MCF10A, les plasmides ont été transfectés avec le FuGENE HD Transfection Reagent (Sigma). Après transfection, les cellules ont été sélectionnées avec des antibiotiques. De plus, NIH3T3 ont été triés par FACS tandis que les cellules MCF10A ont été développées par clonage pour augmenter l'homogénéité de l'expression des biocapteurs.

Nous avons ensemencé 2 * 103 cellules NIH3T3/puits dans une plaque à 96 puits pour les expériences d'imagerie et 1,5 * 106 cellules MCF10A/puits dans une plaque à 6 puits pour le Western Blot. Dans les deux cas, nous avons utilisé des plaques optiques multipuits à fond de verre revêtues de 10 μg/mL de fibronectine pendant une heure avant l'ensemencement. Les cellules ont été privées de nourriture pendant 24 h avant le début de l'expérience.

Pour toutes les expériences, les modèles d'éclairage LITOS ont été créés dans LibreOffice Calc. Pour télécharger les fichiers csv, nous avons connecté un ordinateur portable au point d'accès de LITOS et utilisé l'interface utilisateur. La plaque multi-puits a ensuite été placée sur la matrice LED dans l'incubateur. Pour assurer le bon placement de la plaque de puits, nous avons utilisé un masque en plexiglas spécialement conçu avec une fraiseuse CNC (Fig. S3c supplémentaire). Les cellules ont été autorisées à s'adapter pendant au moins une heure aux conditions de l'incubateur avant le démarrage d'une expérience optogénétique. Si autorisé par le protocole expérimental, nous avons évité d'ouvrir l'incubateur pendant l'expérience. Après stimulation, les cellules ont été fixées en ajoutant le même volume de solution de paraformaldéhyde à 4 % au volume de milieu présent dans le puits. Pour toutes les expériences présentées, les différents points expérimentaux ont été stimulés à des moments spécifiques pour être ensuite fixés simultanément à la fin de l'expérience. Après 10 min de fixation, nous avons lavé les cellules deux fois avec du PBS.

Les images de microscopie à fluorescence à champ large ont été acquises à l'aide d'un microscope Nikon Eclipse Ti équipé d'un 20 × Plan Apo Lambda (NA 0,75) et d'une caméra Andor Zyla 4.2+. Pour l'excitation, nous avons utilisé les sources de lumière LED suivantes : 555 nm pour ERK-KTR et 640 nm pour le marqueur nucléaire). Pour la stimulation de l'optoFGFR, nous avons utilisé une source de lumière LED de 488 nm. L'analyse d'imagerie a été effectuée avec un pipeline établi dans notre laboratoire16. Tout d'abord, nous avons utilisé le logiciel Ilastik (version 1.3.3) pour créer une carte de probabilité des noyaux en utilisant le marqueur nucléaire H2B comme image d'entrée. Ilastik extrait les caractéristiques des pixels à l'aide d'une banque de filtres et les classe à l'aide d'un algorithme de forêt aléatoire. Nous avons ensuite effectué une segmentation d'instance dans CellProfiler (version 3.0.0) et segmenté le cytosol en forme d'anneau commençant à 2 px du noyau et une largeur maximale de 5 px (Fig. 4b). La distance de 2 px entre le noyau et la segmentation du cytosol garantit que l'imprécision dans la segmentation du noyau n'a pas d'impact sur les résultats. Après avoir mesuré le signal ERK-KTR avec ces deux masques de segmentation, nous avons calculé le rapport entre l'ERK-KTR présent dans le cytosol et dans le noyau (rapport C/N). La fluorescence cytoplasmique relative par rapport à la fluorescence nucléaire de la construction KTR (rapport C/N) est en corrélation avec l'activité ERK et peut être utilisée comme indicateur de l'activité kinase dans des cellules individuelles.

Pour le Western Blot, les cellules ont d'abord été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min, puis lysées dans du tampon SDS à 2 % (dans TrisHCl pH 6,8). La concentration en protéines a été déterminée avec le kit d'analyse de protéines Pierce BCA (Réf. 23227, Thermo Scientific). À partir de chaque lysat cellulaire, 10 µg de protéines ont été chargés sur un SDS-Page (gel à 10 % fait maison), puis transférés sur une membrane Western Blot en PVDF (Réf : 3010040001, Roche). La membrane a été incubée avec un anticorps monoclonal de lapin contre l'ERK total (Réf : #4695) ou un anticorps monoclonal de lapin contre la phospho-ERK (Réf : #4370) tous deux de Cell Signaling, puis avec Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (d'âne, NA934VS), comme anticorps secondaire. La membrane a ensuite été développée à l'aide des réactifs de détection Amersham ECL Prime Western Blotting (RPN2232) de GE Healthcare.

Les données de cellule unique sont représentées par des diagrammes en boîte ou par une moyenne avec erreur standard de la moyenne, comme décrit dans la légende de la figure relative. L'analyse des données et les figures ont été créées avec R (version 3.6.3, https://www.r-project.org/)30. Les données correspondantes et les fichiers R-notebook utilisés pour l'analyse des données et la création d'images peuvent être trouvés dans le matériel supplémentaire.

Tous les ensembles de données, y compris les blocs-notes R utilisés pour l'analyse, sont inclus dans les informations supplémentaires.

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Ce travail a été soutenu par la subvention du Fonds national suisse de la recherche scientifique Div3 310030_185376 à Olivier Pertz (Schweizerischer Nationalfonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung). Nous remercions l'atelier technique du Département de chimie, biochimie et sciences pharmaceutiques, le Centre d'imagerie microscopique (https://www.mic.unibe.ch) de l'Université de Berne et Tim Oliver Rod de l'Académie des arts de Berne (https://www.hkb.bfh.ch/fr/) pour leur soutien technique.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Thomas Christoph Höhener et Alex Erich Landolt.

Institut de biologie cellulaire, Université de Berne, 3012, Berne, Suisse

Thomas Christoph Höhener, Alex Erich Landolt, Coralie Dessauges, Lucien Hinderling, Paolo Armando Gagliardi & Olivier Pertz

Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 4058, Bâle, Suisse

Alex Erich Landolt

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TH a conçu la conception de la plaque optogénétique. AL a fait le développement matériel et logiciel. CD a construit le circuit génétique composé de l'optoFGFR, de l'optoRaf et de l'ERK-KTR. PAG a produit les lignées cellulaires MCF10A avec l'optoFGFR, l'optoRaf et l'ERK-KTR. TH a mené et analysé les expériences cellulaires. TH, PAG et LH ont effectué les mesures du champ d'illumination. TH a créé toutes les figures. LH a créé le boîtier imprimé en 3D. OP a supervisé les travaux. TH, PAG et OP ont rédigé l'article. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Correspondance à Olivier Pertz.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Vidéo supplémentaire 1.

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Höhener, TC, Landolt, AE, Dessauges, C. et al. LITOS : un outil d'éclairage LED polyvalent pour la stimulation optogénétique. Sci Rep 12, 13139 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17312-x

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Reçu : 01 mars 2022

Accepté : 25 juillet 2022

Publié: 30 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-17312-x

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